糞便DNA保存液作為Simgen的熱銷產品深受用戶喜愛，咨詢的客戶也很多，之前就有客戶問到產品介紹中描述的“糞便樣本中的DNA經糞便保存液穩定后可在室溫（15-25℃）保存6個月以上而免于降解”有沒有具體的數據資料。當時分光光度計的檢測數據有記錄，但是電泳圖并沒有保存，而且當時取樣量不多，只做了26周測試，后面就因為樣本不夠而無法繼續進行下去了。為了提供完整可信的實驗數據以及探究糞便DNA能不能保存更久的時間，小新采集了樣本進行了糞便DNA保存液保存效果的長期測試。

 

實驗目的：

測試糞便DNA在Simgen糞便DNA保存液中長時間保存的效果。

 

實驗材料：

新鮮采集的人糞便、糞便DNA保存液（Simgen Cat.No.4103050）、糞便DNA純化試劑盒（配套糞便DNA保存液）（Simgen Cat.No.4111050）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）

電熱恒溫培養箱（上虞市滬越儀器設備廠，DHG 303-0）

電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

 

實驗方法：

小新于2022年9月19日采集了5 g糞便樣本，加入了10 ml糞便DNA保存液，旋渦振蕩直至糞便顆粒全部分散溶解后，置于37℃恒溫箱保存至今（除了過年和十一長假，其他時間恒溫箱一直開啟），期間每隔一段時間提取一次DNA。

 

DNA提取操作步驟如下：

1. 將吸頭尖端剪掉，從糞便DNA保存液保存的糞便樣本中吸取100 μl懸濁液，轉移到自備的1.5 ml離心管中。

2. 加入350 μl 70℃溫育的Buffer HST，蓋上管蓋，混合均勻，70℃水浴5分鐘。

3. 12000 rpm離心1分鐘。

4. 吸取20 μl蛋白酶K貯存液，加入到一個1.5 ml離心管管底。

5. 吸取200 μl步驟3中的離心上清加入到該1.5 ml離心管中。

6. 加入200 μl Buffer SL，旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于70℃水浴10分鐘。

7. 加入200 μl無水乙醇，溫和地翻轉4~6次混和均勻。低速離心數秒使管蓋上的溶液沉降到管底。

8. 吸取步驟7中的混合液加入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，離心棄濾液。

9. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WB洗滌純化柱。

10. 高速空離去除殘留液體。

11. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入150 μl 70℃溫育的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，離心得到DNA。

 

實驗結果：

1、在超微量分光光度計上用試劑盒內的Buffer TE調零，測量洗脫下來的DNA，結果如下：

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl洗脫的DNA進行電泳，結果如下：

分析與討論：

1. 糞便樣本經糞便DNA保存液處理后，置于37℃保存至今已達16個月，從分光光度計測量結果來看，每次均成功提取到了DNA，不過濃度略有跳動，總體趨勢上看似乎放得越久濃度越高。

2. 經過電泳檢測分析，當天提取的糞便DNA濃度偏高，應該是由于樣本剛采集，提取到的糞便DNA中混有一些降解的RNA提高了OD₂₆₀的吸收值，這與OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值接近2.0也有對應關系。

3. DNA提取的濃度隨糞便樣本室溫放置的時間延長濃度有升高現象，這是出乎意料的結論。經過認真分析我們認為是以下三個原因所導致：

1） 糞便DNA保存液保存糞便DNA的過程中在緩慢地溶解細菌，隨著時間的延長，釋放到保存液中的DNA就越多，在后續提取DNA的離心步驟（步驟3）中被沉淀丟失的DNA就會越少，顯示出DNA的回收量就越高。

2） 在37℃存放的條件下，釋放到糞便DNA保存液中的DNA還是會緩慢地分解的：這個從電泳分析圖中就可以觀察到，存放1~4個月的樣本中提取的DNA拖尾做少，在存放5~16個月的樣本中提取的DNA中，比較明顯的拖尾就觀察到了。DNA的片段越小，相對而言OD260的吸收值就越高，造成了提取的DNA濃度偏高的假象。

3） 最后我們發現，隨著37℃放置時間的延長，水分會有部分被蒸發，這就相當于糞便DNA保存液被濃縮了，這很可能是16個月存放的樣本提取到的DNA濃度有明顯提高的主要原因。

4. 好消息就是：經Simgen糞便DNA保存液保存的糞便，在為期16個月的測試中，糞便DNA雖然產生了一些拖尾，但是基因組DNA的主條帶依舊清晰可見，無需擔心后續的分子生物學實驗應用。

綜上所述，我們可以得出結論，糞便樣本中的DNA經Simgen糞便DNA保存液穩定后至少可在37℃保存16個月而免于降解。如果將該樣本存放到2~8℃，毫無疑問疑問保存時間可以延長到2~3年。至于加了Simgen糞便DNA保存液的糞便樣本在常溫是否還能保存更久，小新會將測試繼續下去，敬請期待。