分子生物學實驗中，質粒提取是最常見的也是非常重要的一項實驗，是后續實驗的基礎。同學們在質粒提取過程中最煩惱的問題大概就是質粒提取的濃度低，Simgen實驗室有著20幾年質粒DNA提取的經驗，現在結合各個案例作一個分析總結，供大家做參考。

一、客觀因素：

1） 建議認準市場上續存了10年以上的質粒試劑盒生產廠家，不要購買近幾年新推出試劑盒的品牌。

出乎很多人的意料，一個質量穩定的質粒DNA提取試劑盒取決于試劑盒中配套的純化柱，而不是試劑本身。柱子穩定性的問題，做核酸提取試劑盒的廠家幾乎都翻過船（國際大牌QI**EN,曾經的杭州維特潔生化、Ta**ra、OM**A等等）。最后成熟的產品采用了兩條路線，一條是我們Simgen公司一直堅持的路線，把柱子的穩定性做好，把困難和麻煩留給自己。另一條則是擺爛路線，就是Tia**en，Aid**b等公司的質粒試劑盒，為了解決柱子穩定性的問題，額外增加了用平衡液處理柱子的一個操作步驟----把麻煩留給用戶。當然這還算好的，至少質粒DNA還能提取到，最糟糕的就是一些新推出質粒提取試劑盒的公司，試劑盒剛開始用的時候提取質粒DNA的濃度還不錯，幾個月后，質粒DNA就幾乎提取不到，或者提取到的濃度極低了。所以購買質粒提取試劑盒的時候，建議購買品牌已經成立10年以上的公司的產品。

2） 質粒拷貝數低

雖然寫了這個因素，但總體來看，這個因素還是比較少的，除了像BAC，PAC之類的大質粒之外。有一個因素需要提示一下：同樣是一個pUC-19的質粒，空載體pUC-19接近于3K的長度，重組pUC-19質粒如果是插入了一個3K的基因，那么在其他條件相同的情況下，提取到重組的pUC-19質粒DNA的濃度會比空載體pUC-19質粒DNA濃度高一倍左右。具體原因請大家自行腦補。

二、主觀因素： 

1) 細菌的接種（最容易犯的通病）

首先提兩個問題：一、我們培養細菌的時候加入的抗生素是否會直接殺死不帶質粒的大腸桿菌？二、我們做質粒轉化后的平板中的單克隆菌落中，是否只含有一種攜帶質粒的大腸桿菌？

如果你覺得上面兩個問題的答案都是肯定的，那問題就比較大了，因為有了上述兩項錯誤的認知，它會直接指導同學們在細菌接種中跟進各種錯誤的操作。

問題一的答案：抗生素通常是阻止了細菌正常的生理活動，導致的結果是不能繁殖，而非直接殺死細菌。以最常用的氨芐青霉素為例，其機理是阻礙細菌細胞壁的合成，阻礙細胞壁合成的結果，并不等于直接殺死。大家可以回顧一下微生物學中的內容，是不是有一種L型細菌，沒有細胞壁也能活得好好的。

第二個問題的答案和問題一的答案緊密相關：雖然平板中的單菌落是攜帶質粒DNA的大腸桿菌繁殖出來的，但是根據問題一的答案，你還認為單菌落之外的培養基上就沒有活的細菌了嗎？大家腦補一下微觀世界中的場景：這些沒攜帶質粒的細菌都在等待機會，等待抗生素失效后重新繁殖。等不到怎么辦呢？找個大腿抱一下，跟著攜帶質粒的細菌一起繁殖唄，所以答案二是單克隆菌落中是混有不攜帶質粒的大腸桿菌的。

有同學會問：有證據嗎？那請看圖片（估計很多同學也觀察到過類似的現象）：

這是一個轉化實驗后涂的平板在2-8℃冰箱中放置幾天后發生的變化：原來沒有轉化子的位置出現了很多細小的菌落，就是因為抗生素在緩慢地失效，一些等到機會的細菌便開始繁殖了。當然這些細小的菌落圍繞著大菌落的會更密集，為什么呢？這是因為大菌落中的細菌在分泌分解抗生素的酶，大菌落周圍的抗生素都被分解了，小菌落借著大菌落提供的抗性資源在生長繁殖。

了解上述背景知識后，我們來解釋一種同學們最容易犯的細菌接種問題：引用Simgen質粒提取試劑盒的說明書內容要求：從新鮮培養的平板中挑取一個單克隆菌落，接種到3-5 ml含對應抗生素的LB培養基中，37℃，劇烈振蕩培養12-16小時。

有些想偷懶的同學就會想，每次接種細菌都要重新在平板上劃線多麻煩，干脆留一點培養物做種子多簡單？在這里，小新必須點名批評醫學院和藥學院的同學，為什么他們最喜歡這么干？因為他們經常會培養細胞，培養細胞的時候，留一些養好的細胞接種那可是標準的操作步驟哦。而培養細菌時這么操作的后果就是提取到的質粒DNA濃度越來越低。

具體原因解釋如下：因為初代轉化出來的單克隆菌落中混有不帶質粒的大腸桿菌，假如第一代細菌培養物中只含有10%不含質粒的大腸桿菌，取這個菌液再次接種后，不含質粒的大腸桿菌很可能會提高到20%。為什么呢？因為含質粒的大腸桿菌需要額外復制質粒DNA，并且還要表達生產分解抗生素的酶，工作辛苦長得慢，不帶質粒的大腸桿菌靠享用了有質粒的細菌生產的酶帶來的好處，摸魚混日子自然長得快了。當然也不排除有些含質粒的細菌發現丟掉質粒也能生長得挺好（其實是因為別的含質粒的細菌在分解抗生素的原因），身體里懷著質粒寶寶就是個累贅，在繁殖的過程中干脆把質粒丟棄了，變回了不含質粒的普通大腸桿菌。所以，只要你連續用菌液接種幾代，雖然細菌看上去正常生長，但是培養物中含質粒的細菌其實會越來越少，導致提取到的質粒DNA濃度越來越低。

這些同學在反饋問題時通常還都會加上一句：你們的產品一開始用提取到的DNA濃度挺高的，然后濃度越來越低，你們的產品好像很快就失效了…….

我們有個投訴的用戶寄過來一些培養好的菌液，直接提取發現質粒DNA濃度確實很低，但是當我們把提取到的質粒DNA重新轉化了一下，然后挑單菌落提取質粒DNA，濃度提升了10倍以上！ 所以，如果你開始懷疑你保留的菌種中質粒DNA可能有丟失的情況，最簡單的方法就是把質粒DNA重新轉化一次，問題可能很快就解決了。

2) 注意無菌操作

初次做分子生物學實驗的同學通常是謹慎小心的，但到了后期就開始大大咧咧了，因為酶切、PCR之類的都不需要無菌操作。然后呢接種細菌也開始無所謂了……我們碰到過浙江大學的一個實驗室的投訴，他們說用我們的試劑盒提取質粒DNA濃度變低了，還特別提到可能是Buffer II有問題，因為溶菌后溶液不夠透明。由于同一個批次的產品沒有用戶投訴，我們就派了技術支持上門，結果帶回來個驚天大瓜：他們實驗室統一的認知是不需要在超凈臺接種細菌，理由是培養基里已經添加了抗生素了……what?! 估計他們忘了一點，最常用的氨芐青霉素和卡那霉素只對細菌有效，對真菌是無效的啊 ！

       總結一下：Buffer II只能溶解革蘭氏陰性菌（革蘭氏陽性菌也不能溶解），如果發現用Buffer II裂解細菌時不夠透明，比較渾濁，就要懷疑培養的細菌中已經混有真菌了；如果加入Buffer II裂解細菌時不僅渾濁，甚至沒有粘稠感，那更糟糕，證明培養物中根本沒有大腸桿菌，或許挑取接種的是平板上一個真菌的菌落。

3) 從過多的細菌中提取質粒DNA

在一定范圍內，提高細菌用量是能提高質粒DNA回收量的。但是如果使用了過量的細菌，會導致質粒DNA釋放得不夠充分，最后質粒DNA的回收量反而下降。（感興趣的同學可以看一下之前的文章“質粒DNA提取時加大菌液用量會有什么影響？”）當然，不同的菌種，不同的培養基條件下細菌生長的密度都是不同的，那么我們怎么粗略地判斷是否使用了過量的細菌呢？

第一種情況：如果加入裂解液Buffer II裂解細菌時裂解產物非常粘稠，像鼻涕一樣粘稠，翻轉離心管時都難以流動了，可以判斷為使用了過量的細菌。

第二種情況：加入中和液Buffer N8（也包括Buffer III、Buffer N3）后形成的沉淀物難以收縮并分散開來，離心后沉淀不到底部，甚至呈現為膨脹的懸浮狀態，也可以判斷為使用了過量的細菌。

我相信很多同學加大細菌的用量無非是想多提取一些質粒DNA，其實改變培養基的組分可能是更簡便的提高單位體積細菌培養物中質粒DNA含量的方法：將LB培養基中的NaCl含量提高到10 g/L，每毫升LB細菌培養物的質粒DNA得率能提高2 μg左右。

4) 請將提取到的質粒DNA電泳驗證

雖然大多數情況下，提取到的質粒DNA用分光光度計測個濃度和純度就可以進行下一步實驗了。但是如果你觀察到OD₂₆₀/ OD₂₈₀高于1.9的時候，必須要考慮質粒DNA中殘留的RNA已經影響到質粒DNA濃度的定量了，所以請務必用電泳驗證下質粒DNA的濃度。

我們緊跟問題3）中使用過量細菌提取質粒DNA后可能產生的問題：也許正是因為有同學加大細菌用量后測得的濃度有所提高，就變本加厲持續加大細菌的使用量了。但他們很快就會發現OD₂₆₀/ OD₂₈₀都快接近2.0了。這種現象背后真正的原因是菌體釋放的RNA已經超出Buffer I中RNase A能消化的上限了，沒有被消化的RNA片段太長，就會和質粒DNA一起吸附到純化柱上，再一起洗脫下來。這時候電泳驗證一下，就會發現，雖然測OD₂₆₀推算出質粒DNA的濃度挺高，但電泳會發現質粒DNA條帶并沒有變亮甚至變暗了，同時在溴酚藍附近出現了比較明顯的亮斑，這些亮斑就是殘留的RNA，它會極大地提高OD₂₆₀的吸收峰值。

我們看一張電泳圖 ： 

這是有效期內的Buffer I對照加入RNase A的時間已經超過6個月的Buffer I提取5 ml同一菌液中的質粒DNA后的電泳圖。（需要備注的是，為了顯示出殘留的RNA，我們特別上樣了8 μl提取的質粒DNA，并減少了電泳時間。如果上樣量少，或者電泳時間太長，可能就觀察不到這些殘留的RNA了。）電泳看上去質粒DNA亮度差不多的質粒DNA，可分光光度計測得的數據完全不同，見下表：

所以，我們可以得出結論：僅僅這些降解的RNA亮斑就貢獻了接近100 ng/μl 虛高的質粒DNA濃度。我們可以想象一下，新買的質粒試劑盒剛加入RNase A，提取的質粒DNA中沒有RNA殘留，而之前使用的老試劑盒，RNase A加入時間過久，提取的質粒DNA中有RNA殘留，導致新試劑盒提取的質粒濃度遠低于老試劑盒，因此讓你有了新買的試劑盒效果不行的錯覺，但是實際上兩者提取到的質粒DNA是差不多的。

最后我們提示一下在哪些情況下非常有必要用電泳驗證質粒DNA的真實濃度：

A. 提取到的質粒DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀高于1.9

B. 試劑盒的Buffer I中加入RNase A的時間接近或超過6個月了

C. 冬季環境溫度較低，會導致RNase A活性降低；或者在現象上已經可以判斷出使用了過量的細菌的情況下

5) Buffer II有沉淀

如果Buffer II中的沉淀物（是SDS）沒有溶解就使用，結果會怎樣？

我們分別使用有沉淀產生的Buffer Ⅱ、水浴后沉淀消失的Buffer Ⅱ和Buffer NⅡ提取3 ml的同一細菌培養物，提取效果對比如下：

1、2為使用有沉淀產生的Buffer Ⅱ的提取結果；3、4為新配方Buffer NⅡ的提取結果；5、6為水浴后沉淀消失的Buffer Ⅱ的提取結果。

再結合電泳圖看一下：

結合分光光度計測量結果和電泳圖，可以得知低溫情況下Buffer Ⅱ析出白色沉淀時，若一時疏忽沒有發現就直接使用，那質粒得率將會大幅度降低。因此溫度較低時進行質粒提取實驗的同學一定要注意觀察Buffer Ⅱ是否出現沉淀。

看到這有同學會問了，那個Buffer NⅡ是什么？這是我們Simgen特意研發推出替代Buffer II的新產品——在0~10℃的低溫條件下依舊不會產生沉淀，提取效果與沉淀溶解的Buffer Ⅱ提取質粒效果相當，能完美替代Buffer II，解決各位同學的后顧之憂。目前這款產品還在測試階段，后續將會逐步更新到各款質粒提取試劑盒中。